Gli archivi paleo sono fondamentali per capire come le specie reagiscono al riscaldamento climatico, ma sono molto rari nell’Artico. In questo studio, abbiamo combinato analisi morfologiche e tecniche di metabarcode per esaminare un deposito osseo unico nel sistema di grotte di Storsteinhola (68°50′ N 16°22′ E), situato ad alta latitudine in Norvegia. Questo deposito risale a un periodo di riscaldamento climatico, dalla fine del Tardo Glaciale (circa 13.000 anni calibrati prima del presente) fino al massimo termico dell’Olocene (circa 5.600 anni calibrati prima del presente). Le analisi paleogenetiche ci hanno permesso di identificare migliaia di frammenti ossei altrimenti non riconoscibili, creando una sequenza ad alta risoluzione che include 40 specie diverse, tra cui alcune mai documentate prima nella regione. La nostra documentazione dimostra come la borealizzazione degli ecosistemi marini e terrestri a nord del Circolo Polare Artico sia un fenomeno naturale che si ripete nei periodi di riscaldamento, fornendo preziose informazioni sulle attuali trasformazioni dell’ecosistema.
Introduzione
Il riscaldamento globale sta avanzando a un ritmo senza precedenti, con le regioni ad alta latitudine che si riscaldano a un ritmo accelerato rispetto alle altre. Questo riscaldamento è associato allo spostamento delle specie verso i poli, sia in ambienti marini che terrestri, anche se non è chiaro quanto le specie riescano a adattarsi e seguire i cambiamenti degli habitat. I periodi passati di rapido cambiamento climatico possono fornire un’analogia per capire i cambiamenti attuali e futuri, e i paleo-archivi di questi periodi offrono spesso l’unica opportunità per osservare come le specie e le comunità abbiano risposto a precedenti e drammatiche transizioni climatiche e ambientali. Pertanto, questi archivi sono essenziali per migliorare le previsioni sulla resilienza delle specie e sul modo in cui ecosistemi e biodiversità rispondono oggi, soprattutto nelle aree con i più rapidi cambiamenti.
La Fennoscandia ha vissuto drammatiche alterazioni climatiche e ambientali dopo il ritiro della calotta glaciale scandinava durante il Tardo Glaciale, circa 14.600-11.700 anni fa, fino all’inizio dell’Olocene (11.700-8.200 anni fa). Il ritiro dei ghiacci fu seguito da un lungo periodo di riscaldamento, noto come Massimo Termico dell’Olocene (HTM), tra circa 7.500 e 5.500 anni fa, quando le temperature erano più calde rispetto a oggi, fornendo un importante riferimento per il cambiamento climatico attuale e futuro. Tuttavia, comprendiamo ancora poco come fosse distribuita la fauna in Fennoscandia durante questi periodi, in parte a causa della complessità del ritiro glaciale, che rende difficile ricostruire le condizioni climatiche locali. Ad esempio, il ritiro glaciale fu interrotto da pause e periodicamente invertito durante brevi periodi freddi, come lo stadio del Dryas recente (circa 12.900-11.700 anni fa), prima del definitivo scioglimento dei ghiacciai nell’Olocene Antico, circa 9.000 anni fa.
Inoltre, ci sono pochi resti faunistici identificabili provenienti dalle alte latitudini risalenti alla transizione tra Tardo Glaciale e Olocene Antico. Questa scarsità è dovuta alla mancanza di setacciatura sistematica nelle vecchie escavazioni, alle cattive condizioni del suolo per la conservazione delle ossa e all’elevato livello di frammentazione che rende difficile l’identificazione morfologica. Tutti questi fattori hanno ostacolato la nostra comprensione della fauna di questo periodo di cambiamenti ambientali estremi nell’alta latitudine della Fennoscandia.
I pochi resti faunistici identificati in Scandinavia che coprono il periodo Tardo Glaciale-Olocene mostrano che le specie pioniere subartiche e della tundra, come Lepus timidus e Rangifer tarandus, tornarono subito dopo il ritiro della calotta glaciale (24, 26). Queste specie pioniere furono seguite da varie ondate migratorie di specie adattate a climi più caldi durante l’Olocene, mentre il clima e l’ambiente continuavano a cambiare (24, 27). Le rotte di colonizzazione furono diverse: alcune specie si dispersero da sud, attraverso la Danimarca, mentre altre provenivano da nord-est, attraverso la penisola di Kola (23, 28, 29).
Le sequenze fossili provenienti dalla Danimarca rivelano differenze nei tempi di risposta delle specie, fluttuazioni nella biodiversità e periodi di sovrapposizione nelle comunità faunistiche (24). Tuttavia, questi dati sono limitati, poiché dipendono da un esiguo numero di ossa che possono essere identificate morfologicamente e sono geograficamente restrittivi, concentrandosi solo sul sud e il centro della Fennoscandia. Questa limitazione è particolarmente evidente in Norvegia, dove i siti antichi come Skjonghelleren (30), Vistehola (31, 32) e Skipshelleren (33, 34) sono situati nel sud, mentre Sirijorda (28), appena sotto il Circolo Polare Artico, è l’unico sito più a nord. Non esistono sequenze faunistiche note al di sopra del Circolo Polare Artico, e finora nessun insieme faunistico è stato analizzato in Fennoscandia con una metodologia combinata di osteologia e paleogenetica.
Presentiamo un’analisi ad alta risoluzione della diversità faunistica di Nygrotta, un ex ingresso del sistema di grotte Storsteinhola a Kjøpsvik, nel comune di Narvik, in Norvegia settentrionale (Fig. 1A). Nygrotta fu scoperta nel 1993 durante la costruzione di una strada, che rimosse la frana che sigillava l’ingresso (35). Le prime ricerche condotte nello stesso anno portarono alla luce un denso strato di conchiglie, denti di piccoli roditori e ossa di pesci e uccelli datati rispettivamente a 8285 ± 105 e 5805 ± 75 anni prima del presente (B.P.) (35, 36). Queste ricerche preliminari dimostrarono l’unicità di Nygrotta come sito costiero nella Fennoscandia settentrionale, sopra il Circolo Polare Artico, dove sono conservati resti faunistici dell’Olocene Antico e ne evidenziarono il potenziale per l’analisi delle comunità faunistiche dopo il ritiro della calotta glaciale scandinava durante il Tardo Glaciale e nell’Olocene.
Combinando strumenti paleogenetici con analisi osteologiche, possiamo tracciare con precisione la successione e l’insediamento della fauna successiva alla transizione tra il Tardo Glaciale e l’Olocene, fino al Massimo Termico dell’Olocene. I resti subfossili sono stati identificati mediante un approccio misto che unisce l’identificazione morfologica con il bulk-bone metabarcoding (BBM). Questo metodo sfrutta sequenze altamente variabili del genoma mitocondriale come codici a barre per identificare più frammenti ossei contemporaneamente (37, 38). Questa metodologia può rilevare specie da frammenti che altrimenti non sarebbero identificabili, aumentando la rappresentazione della biodiversità del sito (vedi, ad esempio, 39-41). Abbiamo raccolto una sequenza faunistica eccezionale di 40 taxa proveniente da un periodo di cambiamenti climatici e ambientali estremi, evidenziando cambiamenti chiari nella distribuzione delle specie, inclusa la presenza di specie non precedentemente documentate così a nord. Questi risultati forniscono prove che la borealizzazione è stata un fenomeno naturale ricorrente nel passato.
Risultati
Una sequenza di transizione tra il Tardo Glaciale e l’Olocene
Durante i nostri scavi a Nygrotta, abbiamo individuato tre strati stratigrafici distinti (A, B e C) che rappresentano una sequenza risalente alla transizione tra l’interstadio Tardo Glaciale-Younger Dryas e l’Olocene Medio. Questa classificazione è stata possibile grazie alle datazioni al radiocarbonio di cinque conchiglie e un osso (Fig. 1, fig. S1 e tabella S1). Lo strato C, spesso più di 20 cm, è un deposito di sabbia grigia contenente alcuni ciottoli grandi, arrotondati e angolari, ed è stato datato tra 13.069 e 12.744 anni calibrati prima del presente (cal B.P.).
Lo strato B, spesso 25 cm, è un deposito di sabbia che presenta strati suborizzontali irregolari con bande marrone chiaro e nero, dovute rispettivamente al marmo e all’amfibolite. In questo strato, sono stati scavati tre livelli meccanici. Il livello più basso, B3, mostra una maggiore presenza di conchiglie, mentre negli strati superiori, B1 e B2, le conchiglie sono meno frequenti. Le datazioni al radiocarbonio di conchiglie e ossa nei livelli meccanici superiori (B1) e inferiori (B3) si sovrappongono all’interno dell’Olocene Antico, con una gamma combinata tra 9534 e 9006 anni calibrati prima del presente (tabella S1).
Nonostante la presenza di carbone nello strato B, non ci sono indicazioni che derivi da attività umana, ma potrebbe essere il risultato di incendi boschivi o del trasporto di carbone nella grotta attraverso il drenaggio o altri processi naturali. Lo strato più superficiale, A, spesso 2-5 cm, è una sabbia organica marrone che costituisce l’attuale pavimento della grotta. Una conchiglia ha datato questo strato all’Olocene Medio, tra 5948 e 5611 anni calibrati prima del presente (tabella S1), una data che corrisponde al 5805 ± 75 B.P. rilevata durante le indagini del 1993 (35, 36). Dopo questo periodo non si sono accumulati ulteriori sedimenti perché l’ingresso della grotta è stato bloccato dalla frana sovrastante, sigillandola fino alla sua scoperta durante la costruzione di una strada nel 1993.
La Figura 1 presenta una mappa, una fotografia e un diagramma stratigrafico legati all’entrata della grotta di Nygrotta, situata nel villaggio di Kjøpsvik, nel comune di Narvik, in Norvegia.
Parte A della figura mostra una mappa di Fennoscandia con i paesi circostanti, evidenziando la posizione specifica del sistema di grotte di Storsteinhola. Il Circolo Polare Artico è rappresentato da una linea nera che attraversa la mappa, indicando la posizione settentrionale della grotta.
Parte B è una fotografia dell’ingresso di Nygrotta, che offre una vista diretta sull’aspetto attuale dell’entrata della grotta, con la foto scattata da T.K.L.
Parte C del diagramma mostra il record stratigrafico dell’entrata di Nygrotta, dettagliando i diversi strati di sedimenti scavati durante le esplorazioni. Qui, lo Strato A è rappresentato come un sabbioso deposito organico di colore marrone medio che costituisce il pavimento attuale della grotta. Lo Strato B è composto da bande intercalate di marrone chiaro e nero, provenienti da marmo e anfibolite meteorizzati. Lo Strato C, invece, consiste in un deposito di sabbia grigia con inclusi grandi ciottoli arrotondati e angolari. Sette campioni di radiocarbonio, segnati da numeri cerchiati nel diagramma, sono stati prelevati da questi strati per datare i sedimenti, e le relative informazioni sono documentate nella tabella S1.
Questi elementi della figura aiutano a visualizzare e comprendere la composizione geologica e la significativa collocazione storica e geografica dell’entrata della grotta di Nygrotta, fornendo un contesto essenziale per studiare le transizioni ambientali dalla fine dell’ultima glaciazione all’Olocene medio.
Tafonomia e Ricerca Archeologica
Nel corso degli scavi del 2021, abbiamo recuperato un totale di 2381 frammenti ossei. L’analisi tafonomica ha evidenziato un elevato grado di frammentazione delle ossa, ma non ha rivelato segni di abrasione o arrotondamento che suggerirebbero un trasporto attraverso l’acqua. Inoltre, non abbiamo trovato prove convincenti di corrosione o digestione delle ossa da parte di predatori, né segni lineari che potrebbero indicare interventi umani, come incisioni o tagli. La distribuzione dei frammenti ossei era prevalentemente costituita da denti e vertebre, elementi notoriamente resistenti che tendono a conservarsi meglio nel tempo (tabella S2). Inizialmente, alcuni frammenti di quarzo e quarzite con tratti che avrebbero potuto suggerire una manipolazione umana sono stati selezionati per ulteriori analisi dettagliate; tuttavia, esami più approfonditi in laboratorio hanno stabilito che non erano stati lavorati da esseri umani. Non sono state trovate ulteriori evidenze che attestino la presenza umana nel sito.
Identificazione Tassonomica dei Resti Faunistici
Durante l’analisi osteologica dei nostri scavi, abbiamo identificato 161 frammenti ossei (il 6,8% del totale, come riportato nella tabella S3) almeno a livello di famiglia, rappresentanti 12 taxa appartenenti a 8 famiglie, 10 generi e 10 specie (vedi Figura 2 e Tabella 1). Il rimanente 93,2% dei frammenti (2220 in totale) non è stato possibile identificarlo attraverso la morfologia comparativa, e questi sono stati classificati come appartenenti a mammiferi (241 frammenti), pesci (1138 frammenti), uccelli (2 frammenti) e vertebrati non identificabili (839 frammenti), come indicato nella tabella S3.
Per quanto riguarda le analisi del DNA antico (aDNA) effettuate con la metodologia del bulk-bone metabarcoding (BBM), abbiamo ottenuto circa 50,4 milioni di sequenze grezze (tabella S4). Dopo una prima fase di filtrazione e assegnazione tassonomica, abbiamo identificato 165.626 varianti di sequenze per i pesci, 54.764 per i mammiferi e 9.386 per gli uccelli. Queste varianti hanno permesso di identificare 34 taxa, che comprendono 26 famiglie, 28 generi e 23 specie, basandoci su una corrispondenza del 98% per i mammiferi e del 95% per pesci e uccelli (vedi Figura 2, Tabella 1 e tabella S5).
I risultati delle analisi aDNA BBM hanno sistematicamente rivelato un numero maggiore di taxa rispetto alla morfologia comparativa a tutti i livelli tassonomici, in particolare per i pesci (Figura 2). Complessivamente, le analisi hanno permesso di identificare 40 taxa, rappresentanti un totale di 29 famiglie, 32 generi e 28 specie (Figura 2, Tabella 1 e tabella S3). Tra questi, i mammiferi includono 12 taxa, i pesci 21, gli uccelli 6 e gli anfibi 1. Sei taxa, tra cui tre piccoli mammiferi, due pesci e un uccello, sono stati identificati con entrambi i metodi (Tabella 1). Al contrario, 6 taxa, come l’arvicola della tundra (Alexandromys oeconomicus) e il ghiozzetto grigio (Eutrigla gurnardus), sono stati identificati solo tramite metodi osteologici, mentre 28 taxa, tra cui il lemming norvegese (Lemmus lemmus), il gallo cedrone (Tetrastes bonasia) e varie specie di pesci, sono stati rilevati esclusivamente tramite aDNA BBM (Figura 2 e Tabella 1).
La Figura 2 offre un’analisi comparativa del numero di taxa identificati attraverso due differenti metodi: la morfologia osteologica e il bulk-bone metabarcoding (BBM), suddivisi per tre livelli tassonomici: famiglia, genere e specie. Qui di seguito viene descritto in dettaglio il contenuto di ciascun pannello della figura:
A) Tutti i taxa (esclusi i Ranidae): Questo pannello mostra l’efficacia dei metodi su tutti i gruppi di animali analizzati, esclusi i Ranidae. Le barre indicano che il BBM ha identificato un numero maggiore di taxa a tutti e tre i livelli tassonomici, evidenziando in particolare una significativa identificazione di 32 taxa a livello di genere.
B) Aves (uccelli): I risultati specifici per gli uccelli mostrano un equilibrio tra i metodi a livello di famiglia e genere, con ciascun metodo che identifica 5 taxa. A livello di specie, la combinazione dei metodi ha portato all’identificazione di 5 taxa, mentre il BBM da solo ne ha identificati 4 e la morfologia osteologica non ne ha identificato nessuno.
C) Mammalia (mammiferi): Per i mammiferi, il BBM si dimostra ancora una volta più efficace della morfologia osteologica, identificando un numero maggiore di taxa a tutti i livelli tassonomici, con 10 taxa identificati a livello di genere contro i 6 della morfologia osteologica.
D) Pisces (pesci): Questo pannello rivela una netta superiorità del BBM nel rilevare taxa di pesci, con 17 taxa identificati sia a livello di famiglia che di genere, superando di gran lunga i risultati della morfologia osteologica.
Ogni pannello è colorato per differenziare i metodi: il verde chiaro per i risultati combinati, il verde scuro per quelli del BBM e il beige per quelli della morfologia osteologica. I numeri sopra le barre rappresentano il conteggio dei taxa identificati per ciascun metodo e livello. La figura evidenzia chiaramente l’efficacia del BBM nel rilevare un maggior numero di taxa rispetto alla morfologia osteologica, soprattutto nei pesci. Questi dati sottolineano l’importanza di utilizzare approcci multipli per una più completa identificazione tassonomica nei resti archeologici.
La Tabella 1 elenca dettagliatamente i taxa identificati attraverso due principali metodi di analisi — osteologia (OST) e bulk-bone metabarcoding (BBM) — utilizzati per studiare i resti trovati nei diversi strati stratigrafici dell’ingresso di Nygrotta. Questi strati sono datati in anni calibrati prima del presente (cal B.P.) e sono distinti in tre intervalli temporali: 5948–5611 cal B.P., 9534–9006 cal B.P., e 13.069–12.744 cal B.P.
Ogni taxon è elencato con il proprio nome comune in inglese e è contrassegnato per mostrare attraverso quale metodo è stato identificato in ciascun intervallo temporale. Le spunte nelle colonne corrispondenti indicano se un taxon specifico è stato identificato in quel particolare strato attraverso osteologia o metabarcoding.
Per esempio, il “Mountain hare” è stato identificato solo attraverso analisi osteologica nello strato più antico, indicato dal periodo 13.069–12.744 cal B.P. Altri taxa, come il “Norwegian lemming” e l'”Eurasian pygmy shrew”, mostrano segni di identificazione attraverso BBM in tutti e tre gli intervalli temporali, suggerendo una presenza continuativa attraverso i vari strati.
In totale, la tabella presenta 40 taxa, rappresentanti 29 famiglie, 32 generi e 28 specie, evidenziando non solo la ricchezza biodiversità della regione di Nygrotta ma anche l’efficacia dei metodi di analisi utilizzati per decifrare la composizione faunistica di questo sito archeologico. Questa comprensione dettagliata aiuta gli archeologi e i paleontologi a tracciare i cambiamenti nella fauna locale nel corso del tempo e a valutare l’impatto degli eventi climatici e ambientali sulla distribuzione delle specie.
La continuazione della Tabella 1 presenta ulteriori dati sui taxa identificati attraverso il metodo del bulk-bone metabarcoding (BBM) nei tre strati stratigrafici A, B e C dell’ingresso di Nygrotta, ognuno datato a differenti intervalli calibrati prima del presente (cal B.P.). La tabella elenca specifici gruppi di animali marini e un gruppo di anfibi, evidenziando in quali strati questi taxa sono stati trovati.
Dettagli specifici includono:
- ID e English name: Ogni riga rappresenta un taxon differente, identificato dal suo nome comune in inglese, che include una varietà di specie di pesci e un gruppo di anfibi (le rane vere).
- Colonne 5948–5611 cal B.P., 9534–9006 cal B.P., 13.069–12.744 cal B.P.: Queste colonne mostrano la presenza del taxon in ciascun strato temporale basato sui dati ottenuti tramite BBM. Una spunta sotto una colonna indica che il taxon è stato identificato in quel particolare intervallo di tempo.
Per esempio:
- Cottidae (Sculpins) è stato identificato in tutti e tre gli strati stratigrafici, suggerendo una presenza costante attraverso i periodi.
- Taurulus bubalis (Long-spined bullhead) e Cyclopterinae (Lumpfishes) sono stati rilevati solo negli strati B e C, indicando che la loro presenza in questa area è limitata agli intervalli di tempo più antichi.
- Anarhichas lupus (Atlantic wolffish) e altre specie simili sono state rilevate solo nell’intervallo più recente, 5948–5611 cal B.P.
- Ranidae (True frogs) è stato identificato solo nello strato B.
Questa parte della tabella aiuta a comprendere meglio la diversità faunistica del sito di Nygrotta nei diversi periodi storici e l’utilità del metodo BBM nel tracciare la presenza di varie specie nel tempo e attraverso strati sedimentari diversi.
Ricostruzione delle Comunità Faunistiche del Passato
I tre strati sedimentari distinti di Nygrotta documentano tre periodi diversi, dalla transizione Tardo Glaciale all’Olocene Medio. Le ossa trovate non sono distribuite uniformemente nei vari strati. Il deposito più antico, lo strato C, contiene solo il 4% dell’intero assemblaggio, ovvero 97 frammenti. Questi sono principalmente ossa di pesci, tranne tre ossa di piccoli mammiferi della famiglia Arvicolinae e del genere Microtus. Queste ossa di mammiferi sono state trovate nella parte superiore dello strato C, vicino al confine con lo strato B, suggerendo che potrebbero essere penetrate da strati superiori e non rappresentare effettivamente la fauna dello strato C. Le specie ittiche in questo strato appartengono a sei famiglie e almeno tre generi, tra cui taxa artico-boreali come il merluzzo artico (Gaidropsarus argentatus), il merluzzo atlantico (Gadus morhua), la molva (Molva molva) e le famiglie Pleuronectidae e Cottidae.
Lo strato B, risalente all’Olocene Iniziale, contiene il 90% dell’assemblaggio faunistico con 2143 frammenti ossei. Questi includono sette famiglie di mammiferi, con 10 generi e 9 specie, tra cui grandi mammiferi come gli orsi (Ursus) e le lepri (Lepus). La specie Ursus sp., identificata tramite analisi osteologiche, corrisponde all’orso bruno (Ursus arctos), tipico dell’assemblaggio boreale di Nygrotta durante l’Olocene Iniziale. In modo simile, le sequenze di Lepus sp. sono state specificate come lepre di montagna (L. timidus), l’unica specie di Lepus presente in Fennoscandia. In aggiunta a questi grandi mammiferi, abbiamo identificato anche il genere Canis, che include lupi e cani, e abbiamo rilevato un numero significativo di letture di DNA attribuite ai Felidae (gatti).
Il marcatore di DNA usato per il BBM non riesce a differenziare tra il lupo (Canis lupus) e il cane domestico (Canis lupus familiaris), e le sequenze identificate come Felidae corrispondono perfettamente a tre specie: il gatto domestico (Felis catus), il gatto selvatico africano (Felis lybica) e il gatto selvatico europeo (Felis silvestris). Di conseguenza, l’identificazione è stata generalizzata al genere Felis (tabella S6). Abbiamo anche identificato varie specie di piccoli mammiferi, tra cui l’arvicola campestre a coda corta (Microtus agrestis), il lemming norvegese (L. lemmus) e il toporagno comune (Sorex araneus), presenti dal fondo dello strato B, dove compaiono prima di altri piccoli mammiferi nelle tabelle S5 e S7.
Gli unici uccelli trovati nello strato B sono tipici uccelli acquatici, come il pulcinella di mare (Fratercula arctica), i gabbiani (Laridae) e il genere Anser della famiglia Anatidae. I pesci di questo strato appartengono a 14 famiglie, per un totale di 15 generi e 14 specie, come dettagliato nella Tabella 1. Sebbene si siano rilevati tramite aDNA alcuni pesci d’acqua dolce, come il gobione (Gobio gobio) e le loche di fiume (Barbatula sp.), la maggior parte delle specie appartiene a un habitat marino. Queste includono specie indicatrici di ambienti boreali come il merluzzo carbonaro (Pollachius virens), il brosme (Brosme brosme) e il ghiozzetto grigio (E. gurnardus), oltre a specie costiere come il ghiozzo spinoso (Taurulus bubalis) e il grongo roccioso (Pholis gunnellus). Sia il numero di campioni identificati (NISP) sia le letture di aDNA evidenziano che i Gadidae, Pleuronectidae e la molva comune (M. molva) sono predominanti nello strato B, come riportato nelle tabelle S3 e S5.
Lo strato A, risalente al Medio Olocene, comprende il 6% dell’assemblaggio osseo con 141 frammenti, che includono tre famiglie di mammiferi, sei generi e cinque specie, come indicato nella Tabella 1 e nella tabella S3. Felis sp. rappresenta l’unico grande mammifero di questo strato, con il resto composto principalmente da piccoli mammiferi. Il BBM ha identificato gli stessi tipi di topi e toporagni presenti anche nello strato B, ma non è stato trovato DNA di lemming.
Gli uccelli di questo strato appartengono alla famiglia dei Fasianidi, rappresentati da specie come il gallo forcello (Lyrurus tetrix), il gallo cedrone (Tetrao urogallus) e il francolino di monte (Tetrastes bonasia). I pesci, invece, sono distribuiti in sette famiglie, sette generi e sei specie. Interessante notare che due specie di pesci, Esox lucius e Seriola sp., identificate in questo strato, non sono state trovate negli strati inferiori B e C.
Al contrario, le specie d’acqua dolce identificate nello strato B non sono apparse nello strato A. Tuttavia, alcune specie marine boreali, come il carbonaro (Pollachius virens) e la passera pianuzza (Limanda limanda), continuano a essere presenti. D’altra parte, specie adattate al freddo come il merluzzo artico (Gaidropsarus argentatus) e il pesce lupo (Cyclopterus lumpus), comuni nello strato B, non sono state rilevate nello strato A. Inoltre, specie boreali come la molva (Molva molva) e il brosme (Brosme brosme), presenti negli strati precedenti, sono assenti in questo strato, mentre emerge il genere di pesce temperato Seriola nello strato A. Questo suggerisce una variazione nella composizione faunistica attraverso i vari strati, riflettendo possibili cambiamenti ambientali e climatici nell’area di Nygrotta.
Discussione
Utilizzando combinazioni di analisi morfologiche e BBM, abbiamo identificato la sequenza faunistica più diversificata e completa al di sopra del Circolo Polare Artico in Fennoscandia, datata a tre distinti periodi tra 13 e 5.6 mila anni fa. Il sito di Nygrotta mostra una sequenza stratigrafica che evidenzia un progressivo innalzamento dal mare poco profondo alla terraferma, in risposta al rimbalzo post-glaciale. Questo registro dettagliato fornisce importanti informazioni sulle comunità animali del passato e la distribuzione delle specie durante un periodo di intensi cambiamenti climatici.
Inizialmente, abbiamo documentato un fenomeno di borealizzazione nelle regioni artiche, sia terrestri che marine, a seguito del ritiro degli ultimi ghiacci e durante il picco termico dell’Olocene. Inoltre, abbiamo confermato la presenza di numerose specie che si pensava popolassero questa area, ma che non erano state precedentemente documentate nei record fossili. Abbiamo anche osservato specie con areali espansi verso nord, ben oltre le loro attuali distribuzioni geografiche. Queste osservazioni, specialmente quelle relative all’ambiente marino, trovano paralleli evidenti con gli attuali spostamenti delle specie dovuti al riscaldamento globale.
Nello specifico, lo strato C (13,069–12,744 anni fa) corrisponde all’interstadiale del Tardo Glaciale, un periodo di condizioni climatiche variabili in cui i margini della calotta glaciale scandinava si ritiravano rapidamente e il livello del mare era circa 90 metri più alto rispetto a oggi. Vicino a Nygrotta, il ghiaccio si era ritirato più a fondo nel fiordo, e il ritrovamento di specie strettamente marine nello strato C conferma che l’area era sommersa, supportando l’interpretazione di questo deposito come un sedimento marino poco profondo.
Dopo la formazione dello strato C, la calotta glaciale scandinava avanzò nuovamente durante la transizione verso e all’inizio dello stadiale del Dryas Recente. Il ghiaccio raggiunse la foce del fiordo, situata circa 27 km a nord-ovest di Nygrotta, in un’area conosciuta come Tysfjord. Durante questo periodo, le zone costiere erano o prive di ghiaccio o coperte da ghiacciai locali più piccoli e calotte glaciali.
Le specie marine trovate nello strato C riflettono le condizioni climatiche artiche fredde della regione in quel momento. Ad esempio, la specie G. argentatus ha una distribuzione caratteristicamente artica. Altre specie presentano ampie distribuzioni sia negli ambienti boreali che artici, includendo membri delle famiglie Pleuronectidae e Cottidae e specie specifiche come il merluzzo atlantico (G. morhua) e la molva comune (M. molva).
Una comunità ittica simile a quella identificata a Nygrotta, ad eccezione di G. argentatus, è stata scoperta a Blomvåg, l’unico altro sito del periodo analizzato, situato sulla costa meridionale norvegese a circa 1000 km a sud di Nygrotta. Questi ritrovamenti indicano una fauna leggermente più adatta al freddo, senza le specie boreali più calde che sono osservate oggi. Queste osservazioni confermano le ipotesi che le temperature del mare durante il Dryas Recente fossero più fredde rispetto a quelle attuali.
Lo strato B (9534-9006 cal B.P.) appartiene all’Olocene iniziale, un periodo caratterizzato da un aumento graduale delle temperature, che hanno superato quelle attuali dopo circa 9.000 anni fa. Tuttavia, questo periodo ha visto anche episodi intermittenti di raffreddamento. A causa del sollevamento del terreno, i livelli del mare sono significativamente diminuiti durante l’Olocene iniziale, partendo da circa 90 metri sopra il livello del mare e continuando a scendere fino ai giorni nostri. Questo fenomeno è evidente a Nygrotta per l’alta presenza di gusci di molluschi e l’emergere di fauna terrestre nello strato B, stabilendo il livello del mare tra 9.5 e 9 ka cal B.P. a circa 57 metri sopra il livello del mare.
Il deposito sedimentario che compone lo strato B è interpretato come parzialmente influenzato dalle maree, con acqua che ha trasportato sabbia ed eroso rocce locali verso l’interno della grotta. L’accumulo di materiale faunistico marino e terrestre sembra essere il risultato di inondazioni tidali che intrappolano la vita marina insieme ai resti di predatori e prede. Le specie di pesci identificate nello strato C si trovano tutte anche nello strato B. In aggiunta, abbiamo identificato dieci specie con distribuzioni più tipicamente boreali, come il carbonaro (P. virens) e il brosme (B. brosme). Anche vari pesci d’acqua dolce, quali il gobione (G. gobio) e le loche (Barbatula sp.), sono stati individuati come i primi colonizzatori dopo il ritiro dei ghiacciai. Sono state proposte diverse vie di colonizzazione per i pesci d’acqua dolce nel nord della Norvegia, inclusa la migrazione lungo i laghi formatisi ai margini dei ghiacciai, spinti dall’abbondante fusione glaciale, come evidenziato nel caso del lavarello europeo [Coregonus lavaretus].
Inoltre, si ipotizza che alcuni pesci possano essere migrati attraverso i sistemi fluviali svedesi dal Mar Baltico, come indicato per specie quali la perca europea (Perca fluviatilis) e il luccio del nord (62-65). Questi scenari sono plausibili per il G. gobio e il Barbatula sp., che oggi si trovano nel nord della Russia vicino al Mar Bianco e nel Baltico (66). Tuttavia, una catena montuosa a est di Nygrotta potrebbe rappresentare una barriera naturale; di conseguenza, è probabile che le prime migrazioni di pesci d’acqua dolce dopo il ritiro glaciale siano avvenute più a nord, spostandosi poi verso sud fino a Nygrotta. Una migrazione dal sud seguendo il ritiro dei ghiacci appare meno probabile, dato che le popolazioni settentrionali di pesci d’acqua dolce mostrano una maggiore affinità genetica con quelle del Baltico e del nord-est rispetto a quelle del sud della Norvegia (63-65).
Queste osservazioni evidenziano l’espansione rapida di questi colonizzatori d’acqua dolce nelle alte latitudini durante l’Olocene iniziale.
La fauna terrestre dello strato B presenta un andamento simile a quello della fauna marina, con la presenza di colonizzatori boreali precoci come la lepre di montagna (L. timidus), l’arvicola della tundra (A. oeconomus), il lemming norvegese (L. lemmus) e i toporagni (Sorex sp.), seguiti da migranti boreali più tardi come l’arvicola rossiccia (Clethrionomys glareolus) e Microtus sp. (tabella S7). Una dinamica simile è stata osservata in Danimarca, dove si verifica una sovrapposizione tra specie pioniere artiche e specie di foreste e taiga (24). Alcune grandi specie terrestri boreali come l’alce (Alces alces) e la lince (Lynx lynx) sono notevolmente assenti da Nygrotta, ma si ritiene che fossero presenti nella regione, come dimostrato dai ritrovamenti a Sirijorda, un sito situato circa 270 km a sud di Nygrotta e contemporaneo a questo periodo (28).
I mammiferi più piccoli sono abbondantemente rappresentati a Nygrotta e mostrano una diversità simile a quella osservata a Sirijorda, sebbene alcuni taxa di piccoli mammiferi siano stati identificati solo a Sirijorda. Per esempio, il toporagno della taiga (Sorex isodon) e l’arvicola acquatica europea (Arvicola terrestris) non sono stati trovati a Nygrotta, mentre l’arvicola della tundra (A. oeconomus), che si adatta al freddo, è presente a Nygrotta ma assente a Sirijorda. In generale, la varietà di piccoli mammiferi a Nygrotta suggerisce una fauna boreale con colonizzatori iniziali e migratori successivi, tipici degli habitat di praterie, arbusteti e foreste della regione.
L’identificazione dei generi Canis e Felis potrebbe indicare la presenza iniziale di specie come il lupo (C. lupus) e il gatto selvatico (F. silvestris). Tuttavia, è necessario procedere con cautela poiché il marcatore genetico usato non distingue questi animali dai loro corrispettivi domestici. Non essendoci prove di presenza umana sul sito e considerando che le tracce più antiche del cane domestico in Norvegia risalgono a circa 8.5 ka B.P., è improbabile che i cani domestici fossero presenti a Nygrotta. Similmente, l’introduzione dei gatti domestici in Fennoscandia è documentata solo a partire dalla tarda Età del Ferro Romana, e le prime prove in Norvegia provengono dalla sepoltura della nave di Oseberg, molto più recente dei depositi di Nygrotta.
Inoltre, Nygrotta è rimasta sigillata fino al 1993, mantenendo i depositi sedimentari intatti e senza segni di disturbi successivi. Anche se gli animali domestici sono noti per essere contaminanti comuni in laboratorio, nel nostro studio il pattern di amplificazione genetica di Canis e Felis non suggerisce che si tratti di contaminazioni.
Nessuna sequenza di Canis sp. o Felis sp. è stata identificata nei campioni di controllo o nelle amplificazioni dello strato C. Canis sp. è stato amplificato in entrambe le ripetizioni di un singolo campione, mentre Felis sp. è stato amplificato in cinque sottocampioni, e in quasi tutti i casi, in entrambe le ripetizioni. Se questi ritrovamenti fossero dovuti a perdite di DNA, ci aspetteremmo una diminuzione della quantità di DNA contaminante con l’aumentare della profondità. Tuttavia, questo non è stato osservato: Felis sp. è stato amplificato negli strati A e B2, mentre Canis sp. è stato trovato solo nello strato B3. Pertanto, sembra improbabile che il leaching di DNA sia una spiegazione valida, sebbene la perdita di DNA sia stata studiata come fonte di contaminazione nel DNA sedimentario e debba ancora essere indagata nel caso di ossa in massa.
Se i campioni di Nygrotta rappresentassero effettivamente il gatto selvatico (F. silvestris), sarebbe notevole perché indicherebbe la localizzazione più settentrionale mai registrata per questa specie. Questa potenziale identificazione autentica di gatti selvatici è particolarmente eccitante, considerando che i resti di questa specie sono rari in Europa. In Fennoscandia, il gatto selvatico è stato documentato a Sjælland, Danimarca, come parte della fauna boreale risalente a 9.5 ka B.P. In Norvegia, i gatti selvatici sono stati trovati solo in tre siti: Vistehola (circa 8.5 ka B.P.), Auve (tra 5 e 4 ka B.P.), e il rifugio roccioso di Årdal (tra 4 e 3 ka B.P.), tutti situati nel sud della Norvegia, a circa 850-1000 km a sud di Nygrotta. L’ultima testimonianza di gatti selvatici in Fennoscandia proviene dal sito di Næsbyholm, in Danimarca, e risale a 2000 anni cal B.P. La specie si estinse in Fennoscandia dopo la fine del Massimo Termico dell’Olocene, quando le temperature scesero e la copertura nevosa superò i 20 cm per un periodo di 100 giorni, condizioni non più sostenibili per i gatti selvatici.
Le stime precedenti limitavano la distribuzione storica del gatto selvatico alla costa sud-occidentale della Norvegia, ma la nostra potenziale scoperta a Nygrotta suggerisce che la loro area di diffusione potrebbe essersi estesa ben più a nord già durante l’Olocene iniziale, almeno lungo la linea costiera. Questa presenza precoce del gatto selvatico indicherebbe anche quantità di neve relativamente basse lungo le coste norvegesi in quel periodo e suggerirebbe che le foreste boreali di pini e betulle in Norvegia dal 8 ka B.P. fornivano un habitat adatto per questa specie.
Lo strato A (5948–5611 cal B.P.), interpretato come sabbia trasportata da processi subaerei, coincide con il tardo Massimo Termico dell’Olocene, localmente datato tra 7.5 e 5.5 ka cal B.P. nel nord della Norvegia. Con temperature stimate da 1.5° a 2.4°C più calde rispetto alle norme climatiche del 1961-1990, la presenza di specie adattate a climi più caldi durante questo periodo era attesa. Abbiamo osservato il genere Seriola, che normalmente vive in acque temperate e tropicali. Variazioni passate nella distribuzione di specie ittiche di acque calde sono state precedentemente documentate anche in Svezia durante il tardo Olocene. In particolare, questo spostamento verso nord della Seriola è simile alle osservazioni moderne di Seriola dumerili che si sposta verso nord nel Canale della Manica.
L’avifauna a Nygrotta durante il tardo HTM mostra un cambiamento da specie acquatiche a terrestri, come il gallo forcello e il francolino di monte. Questa transizione potrebbe riflettere non solo l’aumento della distanza dall’acqua man mano che il livello del mare continuava a diminuire durante l’Olocene, ma anche la presenza di densi habitat boschivi nelle vicinanze.
Il possibile gatto selvatico e la comunità di piccoli mammiferi presenti nello strato B sono stati identificati anche nello strato A, ma non sono stati rilevati colonizzatori terrestri precoci come lepri e lemming, che ci si aspetterebbe di trovare considerando la loro presenza in siti contemporanei in Fennoscandia e le condizioni climatiche adatte. Nel complesso, il record faunistico conferma il clima caldo noto dal tardo HTM e fornisce evidenze di transizioni di specie e spostamenti verso nord, offrendo scenari comparativi utili per comprendere le risposte al riscaldamento climatico attuale.
La cronologia faunistica marina e terrestre di Nygrotta documenta un lungo periodo di notevole riscaldamento climatico sopra il Circolo Polare Artico. Non esistono record vicini che consentano un confronto diretto dell’intera cronologia, poiché questi sono limitati nel tempo, posizionati più a sud, differiscono nel tipo di deposito o nella modalità di accumulazione. La cronologia di Nygrotta è quindi la prima a dimostrare un cambiamento consistente nella struttura delle comunità faunistiche, sia marine che terrestri, in risposta a un significativo riscaldamento.
Specificamente, abbiamo osservato l’emergere di specie adattate al caldo, come le ricciole (Seriola sp.), durante il tardo HTM. Analogamente, nel contesto terrestre, si è notato l’apparire di specie più adatte a climi temperati, come il francolino di monte (T. bonasia), durante l’Olocene iniziale e l’HTM. Infine, anche se non possiamo confermare che le specie presenti nello strato B siano assenti nello strato A a causa delle differenze nel conteggio delle ossa tra i due strati, notiamo l’assenza di specie adatte al freddo, come G. argentatus, nello strato A che copre l’HTM.
Questa osservazione corrisponde alla presenza di specie adattate a climi più caldi, come Seriola sp. e il francolino di monte (T. bonasia), nello strato A, ma non nel B, coincidendo con un clima dell’Olocene medio in riscaldamento. Inoltre, la successione dei pesci d’acqua dolce evidenzia una rapida colonizzazione degli habitat disponibili, che si verifica parallelamente alla scomparsa della calotta glaciale scandinava. L’apparizione di specie come il gallo forcello (L. tetrix) e il francolino di monte (T. bonasia) indica che il clima dell’epoca supportava un habitat boschivo denso durante l’HTM.
Abbiamo così ottenuto prove convincenti di significativi cambiamenti nelle comunità faunistiche marine e terrestri dell’alto Artico durante l’Olocene, mostrando che la borealizzazione è un fenomeno naturalmente ricorrente in periodi di riscaldamento. Anche se a Nygrotta non disponiamo di una sequenza continua, che limita l’analisi dettagliata del ritmo della borealizzazione in questo periodo, diversi taxa nell’assemblaggio indicano un rapido adattamento all’habitat disponibile a seguito dello scioglimento delle calotte glaciali, come Seriola sp., G. gobio e M. agrestis.
Questa rapida espansione, conseguenza del riscaldamento globale in atto, è stata osservata anche nelle specie marine che avanzano verso le acque artiche. Tuttavia, nei sistemi terrestri, i taxa sono ora limitati dalle modifiche umane dei paesaggi, il che porta a una più lenta adattabilità agli habitat in mutamento. Le analisi della sequenza faunistica identificata a Nygrotta colmano una lacuna cronologica e geografica nella nostra comprensione della ricolonizzazione della parte più settentrionale della Fennoscandia durante un periodo di drastico cambiamento climatico seguito alla fine del periodo glaciale tardivo.
Combinando l’osteologia con il metodo BBM del DNA antico, siamo riusciti a esaminare migliaia di frammenti ossei morfologicamente non identificabili recuperati dal sito. Questo esemplifica la potenza dell’integrazione tra approcci paleogenetici e osteologia tradizionale per massimizzare il contenuto informativo e la risoluzione ottenibile da questi record. In questo caso, abbiamo ottenuto una sequenza faunistica ad alta risoluzione che copre il periodo dal passaggio dal Tardo Glaciale all’Olocene fino al tardo Massimo Termico dell’Olocene (HTM). Considerato più caldo di oggi, l’HTM è spesso paragonato alle previsioni climatiche del futuro prossimo, e la transizione verso questo periodo potrebbe offrire indicatori utili per comprendere le reazioni delle specie attuali e future.
È interessante notare che gli assemblaggi faunistici dell’HTM in Fennoscandia sono quasi sempre fortemente influenzati dall’attività umana, il che sottolinea l’importanza di siti rari come Nygrotta e Sirijorda, dove le reazioni faunistiche non sono offuscate da interventi antropogenici. Questi archivi paleo-naturali rappresentano finestre uniche sui cambiamenti passati delle specie e delle comunità.
La Figura 3 è un diagramma di Venn che illustra la distribuzione dei taxa identificati attraverso i tre strati stratigrafici (Layer A, B e C) nella grotta di Nygrotta, mostrando come i vari gruppi animali si sovrappongono tra i diversi strati. Ecco una spiegazione dettagliata:
- Silhouette degli animali e colori:
- Aves (Uccelli): Rappresentati dalle silhouette di uccelli.
- Mammalia (Mammiferi): Rappresentati dalle silhouette di mammiferi.
- Pisces (Pesci): Rappresentati dalle silhouette di pesci.
- Amphibia (Anfibi): Rappresentati dalle silhouette di anfibi.
- Distribuzione per strato:
- Layer A (rosa): Questo strato contiene 3 taxa di uccelli, 6 taxa di mammiferi e un numero non specificato di pesci e anfibi.
- Layer B (giallo): Qui si trovano 3 taxa di uccelli, 3 taxa di mammiferi, 5 taxa di pesci e un numero non specificato di anfibi.
- Layer C (blu): In questo strato sono presenti taxa non specificati per ciascun gruppo.
- Intersezioni:
- Le aree dove i cerchi si sovrappongono mostrano i taxa condivisi tra i vari strati. Ad esempio, l’area di intersezione tra i Layer A e B indica i taxa che si trovano in entrambi gli strati, ma non nel Layer C.
Questa rappresentazione aiuta a visualizzare la biodiversità riscontrata in ciascun strato e le sovrapposizioni di specie tra gli strati, fornendo indizi sulla continuità o variazione della fauna nel tempo all’interno della grotta. Il diagramma facilita la comprensione di quali gruppi animali fossero più prevalenti in ciascun strato e come questi si relazionino tra loro attraverso gli strati diversi.
Materiali e Metodi
Scavo dei resti subfossili
Il sistema di grotte carsiche di Storsteinhola è situato vicino al villaggio di Kjøpsvik, nel comune di Narvik ai margini del Tysfjord, nella contea di Nordland, nel nord della Norvegia. Il sistema completo delle grotte si estende per circa 2.6 km con un’altezza massima di 40 metri. Nel 2021, abbiamo effettuato scavi all’ingresso di Nygrotta, posizionato attualmente a circa 57 metri sul livello del mare. Gli scavi sono stati realizzati seguendo tecniche archeologiche standard, impiegando un sistema di griglia con l’asse x orientato da nord a sud e l’asse y da est a ovest. Ogni quadrato di 1 metro è stato suddiviso in quadranti (NE, SE, SW e NW). Ci siamo concentrati sul materiale faunistico recuperato dal quadrante nord-ovest del quadrato 106X/201Y, mentre gli assemblaggi faunistici degli altri tre quadranti sono stati preservati per ricerche future. Il quadrato 106X/201Y si trova nella parte interna del primo atrio di Nygrotta ed è stato scavato fino a una profondità di 0.5 metri. I sedimenti sono stati lavorati seguendo principi stratigrafico-meccanici, con strati meccanici di 10 cm scavati all’interno degli strati stratigrafici. Tutti i sedimenti scavati sono stati setacciati bagnati attraverso maglie da 4 e 2 mm per ottimizzare il recupero di piccoli frammenti. I sedimenti setacciati sono stati asciugati e conservati a 4°C per ridurre la degradazione del DNA post-scavo. Il recupero dei frammenti ossei è stato effettuato in un ambiente separato, indossando equipaggiamento protettivo per minimizzare la contaminazione del DNA e usando lampade per ingrandimento.
Datazione al Radiocarbonio e Quadro Cronologico
Sette campioni sono stati selezionati per la datazione al radiocarbonio presso il Laboratorio Nazionale per la Determinazione dell’Età dell’Università Norvegese di Scienza e Tecnologia a Trondheim (vedi fig. S1 e tabella S1). La calibrazione delle date è stata effettuata utilizzando il software OxCal versione 4.4.4. Sei di questi campioni presentavano un valore di δ¹³C che suggeriva l’influenza dell’effetto del serbatoio marino. Questi esemplari sono stati calibrati con la curva di calibrazione marina Marine20, applicando un offset ΔR di -100 ± 37, basato su dati provenienti da Tromsø in Norvegia, il punto più vicino al sito di scavo. Il campione DRY6, che mostrava un valore di δ¹³C indicativo di una dieta terrestre, è stato calibrato utilizzando la curva di calibrazione IntCal20 per l’emisfero settentrionale. Le fasce di età calibrate riportate rappresentano una probabilità del 95.4%. Le età numeriche per periodi definiti come l’Olocene iniziale sono derivati dalla carta cronostratigrafica aggiornata nell’aprile 2023 dalla Commissione Internazionale sulla Stratigrafia.
Archeologia
Gli scavi a Nygrotta sono stati condotti seguendo metodologie archeologiche alla ricerca di segni di resti umani, strutture costruite, focolari, artefatti e rocce frantumate dal calore. Potenziali manufatti di quarzo e quarzite, che potrebbero essere stati lavorati dagli umani, sono stati raccolti e analizzati in laboratorio per identificare segni di lavorazione come la scheggiatura. Inoltre, i resti faunistici sono stati esaminati per identificare tracce di macellazione, segni di taglio, morsi umani e qualsiasi indicazione di specie domestiche o pattern di sfruttamento che potrebbero suggerire una presenza umana. È stata anche condotta un’attenta analisi dei sedimenti setacciati alla ricerca di materiali organici come carbone e semi carbonizzati.
Analisi Osteologica
L’analisi osteologica dell’assemblaggio faunistico è stata effettuata attraverso la morfologia comparativa, confrontando i resti ossei recuperati con ossa moderne di specie note, utilizzando la collezione di riferimento del Museo Universitario di Bergen. L’abbondanza delle specie è stata quantificata basandosi sul NISP (Numero di Specimen Identificati per Specie). Ove possibile, i frammenti appartenenti a un unico esemplare sono stati contati come uno, per evitare una sovrarappresentazione delle specie. Data la limitata quantità di materiale disponibile e l’unicità del sito, tutti gli elementi ossei sono stati considerati nei conteggi del NISP, inclusi vertebre e falangi. Per evitare sovrarappresentazioni nel calcolo del numero di taxa, abbiamo contato le identificazioni a livello di genere e specie, mentre il livello familiare è stato conteggiato solo quando non esistevano identificazioni a livello di specie o genere all’interno di quella famiglia. I marcatori tafonomici sono stati registrati laddove presenti seguendo le linee guida specificate. Per minimizzare la contaminazione, durante la manipolazione delle ossa sono sempre stati utilizzati mascherine e guanti.
Metabarcoding dei Tessuti Ossei
I frammenti ossei non identificabili tramite morfologia comparativa sono stati suddivisi nelle categorie Mammalia, Pisces, Aves e vertebrati non identificabili, a seconda del loro strato sedimentario. È stato preparato un campione aggregato per ogni categoria e per ogni strato (A1, B1, B2, B3 e C1). Questi campioni completi sono stati ridotti in frammenti di circa 1 mm³ utilizzando un mortaio e pestello in acciaio inossidabile. Quando disponibile, sono stati prelevati fino a tre sottocampioni di circa 110 mg ciascuno per l’estrazione del DNA per ogni gruppo tassonomico e strato, come dettagliato nella tabella S8. In totale, sono stati macinati venti campioni aggregati e, con l’aggiunta di sottocampioni, il DNA è stato estratto da un totale di 47 campioni.
I protocolli di predigestione ed estrazione del DNA seguono quelli descritti da Lord et al. I campioni sono stati predigeriti per 30 minuti e poi digeriti durante la notte a 55°C. Gli estratti sono stati successivamente concentrati e purificati prima di procedere all’amplificazione, utilizzando fino a tre coppie di primer specifiche per mammiferi, pesci e uccelli, rispettivamente (Mamp007, Fish16S, Aves12S; per dettagli vedere il Testo Supplementare).
Tutti i processi di laboratorio pre-reazione a catena della polimerasi (PCR) sono stati effettuati nel laboratorio dedicato al DNA antico presso l’Università di Oslo, seguendo protocolli standard per minimizzare i rischi di contaminazione.
I dati sono stati elaborati utilizzando il pacchetto OBITools v.1.2.12, disponibile su OBITools, seguendo questa pipeline specifica. Per l’assegnazione tassonomica, le sequenze sono state confrontate con librerie di riferimento create per ciascuna coppia di primer attraverso un PCR in silico effettuato sui database della European Molecular Biology Laboratory e del National Center for Biotechnology Information.
Le sequenze sono state poi filtrate in R v.4.3.0, disponibile su R Project, eliminando quelle con una corrispondenza inferiore al 95% per pesci e uccelli e al 98% per i mammiferi, oltre a quelle con un conteggio totale di letture sotto le 200, e repliche di PCR con meno di 100 letture totali. Le identificazioni tassonomiche ottenute dalle repliche di PCR sono state aggregate, dato che non sono state riscontrate differenze significative tra di esse.
L’elenco finale dei taxa è stato esaminato da tassonomisti specializzati nei rispettivi gruppi. Inoltre, è stato utilizzato il Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool del NCBI per affinare ulteriormente le identificazioni tassonomiche e apportare le necessarie correzioni.
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adk3032